【课题套路】Mol Cancer教你轻松get m6A甲基化研究思路

Hi~我是Linlin，好久不见~

今天没有胖师兄，我终于可以自己solo（bai tuo ta）了~

最近好像Molecular Cancer总被吐槽，主要是因为这个期刊发表的研究套路居多（下次和大家好好分析分析），但是并不影响它影响因子持续走高，已经突破15。今天就带大家看一看怎样的套路可以发表在这一高达15分的期刊上。

m6A甲基化研究无非是围绕着甲基化转移酶(Writers)、去甲基化酶(Erasers)和甲基化阅读蛋白(Readers)这三大组分展开相应的研究，那么如何才能在众多的m6A甲基化研究中展露头角，发表在高分期刊上呢？

今天要给大家介绍的这篇文章是今年5月份发表的，名为“RNA demethylase ALKBH5 prevents pancreatic cancer progression by posttranscriptional activation of PER1 in an m6A-YTHDF2-dependent manner”，通读全文，你会发现文章好像亮点也不是特别多，很多都是常规的分析思路，那么我们一起来看下，为什么你类似的研究不能像它这样发高分。

一、研究背景：

胰腺癌(PC)是一种起病隐匿、早期诊断困难、手术切除率低的高恶性胃肠道肿瘤，是最常见的致命肿瘤之一。PC患者的5年生存率仅为8%，因此，迫切需要阐明PC的分子和细胞机制，以提高诊断和治疗效果。ALKBH5是关键的m6A去甲基化酶，已有研究表明其参与肿瘤的发生发展，然而，ALKBH5在PC中的病理作用尚不清楚，有待进一步研究。

二、主要研究结果：

1. PC中ALKBH5的表达及预后分析

研究人员首先分析了ALKBH5在临床PC样本中的表达情况，RT-qPCR结合免疫组化以及WB检测结果均显示ALKBH5在PC样本中低表达，同时分析发现ALKBH5低表达样本中m6A甲基化水平较高（ALKBH5是去甲基化酶，它的表达量降低，相应的m6A甲基化水平升高，这个倒也不难理解）。生存曲线分析显示ALKBH5低表达患者预后较差。上述结果表明ALKBH5缺失可作为PC的预测和预后指标。

2. ALKBH5的生物学功能研究

为确定PC中ALKBH5的生物学功能，研究人员进行了体内外实验研究：

体外实验：

敲除/过表达ALKBH5，分析细胞表型变化，结果显示ALKBH5能够抑制PC细胞的增殖、迁移和侵袭，使细胞滞留在G2/M期。

体内实验：

构建了ALKBH5敲减/过表达异种移植瘤小鼠模型和原位瘤小鼠模型，结果均显示ALKBH5能抑制肿瘤生长和转移（这里除了进行形态学检测外，还对细胞增殖和转移相关的基因进行了检测，以进一步确定ALKBH5对肿瘤的影响）。 

3. ALKBH5靶基因PER1的分析

为确定ALKBH5是如何参与调控PC的，研究人员对ALKBH5过表达细胞系进行RNA-seq分析，GO和KEGG结果显示差异表达的基因大多与转录调控相关，提示ALKBH5可能通过影响基因转录参与调节PC（这一步是从整体水平上分析ALKBH5可能参与的分子调控作用，同时也是为了与后续的m6A-seq结果联合分析）。

为确定ALKBH5潜在的靶基因，研究人员进行了m6A-seq分析，并结合m6A input RNA-seq结果以及之前的RNA-seq结果，筛选出9个高甲基化水平的基因。进一步分析发现过表达ALKBH5，其中一个基因PER1 3’-UTR区高甲基化明显减弱，提示其可能为ALKBH5的靶基因（ALKBH5是去甲基化酶，那么理论上它的靶基因应该是高甲基化的）。

为进一步确定靶基因PER1，研究人员对ALKBH5进行了敲减/过表达处理，结果显示PER1 mRNA水平出现了相应的正相关表达变化；甲基化抑制剂（DAA）处理显著上调PER1的mRNA水平（这一部分结果显示ALKBH5与PER1 mRNA之间是表达正相关的）。

与此同时，MeRIP-qPCR分析显示敲减/过表达ALKBH5，PER1的甲基化水平出现相应的高/低变化；对PER1的m6A甲基化位点进行突变处理，荧光素酶报告实验结果显示荧光素酶活性增强（这一部分结果显示ALKBH5与PER1 m6A甲基化水平之间是负相关）。上述结果表明ALKBH5调控PER1的mRNA水平及m6A甲基化水平。 

对PER1的序列进行分析，结果显示其甲基化修饰位点与YTHDF2结合位点临近。敲减YTHDF2，PER1的mRNA水平上升，提示ALKBH5可能通过抑制YTHDF2对PER1 mRNA的降解作用而上调PER1的mRNA水平（YTHDF2是m6A阅读蛋白，它的一个重要作用是能介导靶基因mRNA的降解）。

4. PER1的生物学功能分析

为进一步确定靶基因PER1，对临床样本中PER1的表达水平进行了检测，结果显示为低表达。生存分析显示PER1低表达患者预后不良。同时，临床样本和TCGA数据分析以及免疫组化分析均显示PER1与ALKBH5的表达水平正相关（临床样本中PER1的表达量检测必不可少，这是因为需要理论与实际相联系）。

细胞表型实验表明过表达PER1能部分逆转ALKBH5敲减引起的细胞表型变化（这里是功能回复实验，也是进一步证明PER1与ALKBH5之间表达正相关）。

与此同时，研究发现过表达PER1能重新激活因ALKBH5敲减而受影响的ATM相关信号通路，Co-IP实验证实PER1与ATM之间存在相互作用关系（ATM是多个信号级联的关键调控因子，一旦ATM被激活，它能磷酸化多种底物，其中，Chk2和p53介导了ATM的许多细胞周期效应）。

5. PER1通过P53反馈调节ALKBH5转录

异位表达p53，结果显示ALKBH5的水平显著升高，同时免疫组化分析显示P53高表达显著降低整体的m6A甲基化水平（文章没有具体说明为什么会做一部分，是如何想到要做这一部分的，猜测是研究人员是把ATM相关的基因都检测了一遍，然后发现p53跟ALKBH5表达正相关）。基因组分析显示ALKBH5启动子区含有两个p53结合位点，因此研究人员设计了两个覆盖p53结合位点的引物，Chip分析显示p53能与这两个位点结合。荧光素酶实验进一步证实P53能与ALKBH5的启动子区结合。TCGA数据分析显示，P53与ALKBH5表达正相关。

上述结果表明p53可以通过与ALKBH5的启动子结合而激活其转录。 

三、总结

文章围绕着m6A去甲基化酶ALKBH5展开，分析确定了PC中低表达的ALKBH5无法抑制YTHDF2对PER1 mRNA的降解作用而导致PER1 mRNA水平下降以及下游ATM信号通路的失活，进而抑制了细胞周期进展，ATM通路中表达下调的p53又会进一步反馈抑制ALKBH5的表达，从而形成了一个转录调控环路。

文章所用的实验技术较为常规，但思路清晰，层层递进，看似简单的结果背后都有强大的数据和实验支撑，但值得我们借鉴。文章对于ATM信号通路及p53的选择研究这一块并没有详细说明，想必这一块分析的背后工作量不小，中间摸索的过程作者也就懒得过多赘述了。

文章假说图：

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